Leishmania infantum in the reproductive organs of dogs / Leishmania infantum em órgãos reprodutivos de cães

ABSTRACT: Leishmania infantum causes canine leishmaniasis. Using parasitological and molecular analyses, we identified L. infantum in the reproductive organs of male and female dogs. Using histochemistry, immunohistochemistry, and PCR, we examined tissue samples from the reproductive organs of 8 male dogs and 16 female dogs diagnosed with leishmaniasis. Despite the absence of macroscopic or microscopic lesions in these organs, we observed L. infantum amastigotes in tissue samples from the testis and the uterus. PCR and sequencing of these tissues revealed sequences that matched 100% with L. infantum DNA available at GenBank. The presence of L. infantum amastigotes and DNA in testicular and uterine tissue samples suggested that these organs can harbor the parasite without associated macroscopic or microscopic lesions, and this can be especially important in the vertical and venereal transmission of leishmaniasis in dogs.

RESUMO: Leishmania infantum é agente etiológico da leishmaniose canina. Por meio de análises parasitológicas e moleculares, a presença do parasita foi investigada em órgãos reprodutivos de cães machos e fêmeas. Amostras de tecidos dos órgãos reprodutivos de 8 cães machos e 16 fêmeas diagnosticados com leishmaniose foram avaliadas por histoquímica, imunohistoquímica e PCR. Apesar de não terem sido observadas lesões macroscópicas ou microscópicas nos órgãos reprodutivos desses cães, formas amastigotas de L. infantum foram observadas em amostras teciduais do testículo e útero. A PCR e o sequenciamento do DNA extraído desses tecidos revelaram sequências 100% idênticas a L. infantum depositadas no GenBank. Nossos resultados sugerem que os testículos e o útero podem abrigar o parasita, sem associação com lesões macroscópicas ou microscópicas, o que pode ter uma grande importância na transmissão venérea e vertical da leishmaniose entre cães.

Molecular detection of Leishmania infantum DNA according to clinical stages of leishmaniasis in dog / Deteção molecular de DNA de Leishmania infantum em diferentes estágios clínicos da leishmaniose em cães

Abstract The aim of this study was to compare molecular tests used to diagnose Leishmania spp. in dogs with different stages of infection. Blood and conjunctival swab (CS) samples from dogs classified in four clinical stages were subjected to different PCR protocols (13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S and LEISH-1/LEISH-2 primers). To the study, 22.3% (48/215) of dogs were classified as without clinical signs, 67.5% (145/215) stage I (mild disease), 7.0% (15/215) stage II (moderate disease) and 3.2% (7/215) stage III (severe disease). The results showed that in blood samples, 13A/13B detected a significant higher number of positive dogs in stage I (25/145) and in total (42/215) (p≤0.05). However, when CS samples were tested, no difference was observed (p>0.05). On the other hand, in blood samples, MC1/MC2 detected significantly fewer positive dogs classified as without clinical signs (0/48), in stage I (0/145) and in total (1/215) (p≤0.05). Likewise, in CS samples, this primers showed also lower detection (1/215) (p≤0.05). So than, we can conclude that PCR on blood samples with 13A/13B primers has greater capacity to detect positive dogs, mainly at the initial of clinical disease than do other primers and MC1/MC2 are not a good choice to detect Leishmania infantum infection in dogs.

Resumo O objetivo deste estudo foi comparar testes moleculares usados para diagnosticar Leishmania spp., em cães apresentando diferentes estágios de infecção. Amostras de sangue e suabe conjuntival (SC) de cães classificados em quatro estágios clínicos foram submetidas a diferentes PCRs (primers 13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S e LEISH-1/LEISH-2). Para o estudo, 22,3% (48/215) dos cães foram classificados como sem sinais clínicos, 67,5% (145/215) estágio I (doença leve), 7,0% (15/215) estágio II (doença moderada) e 3,2% (7/215) estágio III (doença grave). Os resultados mostraram que, em amostras de sangue, 13A/13B detectou número significativamente maior de cães positivos no estágio I (25/145) e no total (42/215) (p≤0,05). No entanto, quando as amostras de SC foram testadas, nenhuma diferença foi observada (p>0,05). Por outro lado, no sangue, MC1/MC2 detectou significativamente menos cães positivos sem sinais clínicos (0/48), em estágio I (0/145) e no total (1/215) (p≤0,05). Da mesma forma, em amostras de SC, MC1/MC2 também apresentou menor detecção (1/215) (p≤0,05). Assim, a PCR em amostras de sangue com 13A/13B tem maior capacidade de detectar cães positivos, principalmente no início da doença do que outros primers, e o par de primers MC1/MC2 não é uma boa escolha para detectar infecção por Leishmania infantum em cães.

Molecular detection of Leishmania spp. in cattle from Brazil by means of PCR using internal transcribed spacer 1 / Detecção molecular de Leishmania spp. em gado no Brasil por PCR com espaçador interno transcrito 1

Abstract Leishmania spp. are important agents of human and animal leishmaniases that have an important impact on public health. In this study, we aimed to detect the circulation of Leishmania spp. in cattle from a visceral leishmaniasis non-endemic area of the state of São Paulo, Brazil. DNA was extracted from blood samples from 100 heifers in the municipality of Pirassununga and was amplified using primers specific for the first internal transcriber spacer (ITS1), to assess the presence of trypanosomatids. The assays revealed that one sample presented bands of between 300 and 350 base pairs. In GenBank, this sample matched 100% with Leishmania infantum (314 base pairs). The results suggest that cattle can be infected by Leishmania infantum in Brazil.

Resumo Leishmania spp. são agentes causadores das leishmanioses em humanos e em animais, gerando grande impacto à saúde pública. Este estudo objetivou detectar a circulação de Leishmania spp. em área não endêmica para leishmaniose visceral de São Paulo, Brasil. Foram extraídas amostras de DNA de 100 novilhas da cidade de Pirassununga. Estas amostras foram amplificadas com os iniciadores específicos para tripanosomatídeos Internal Transcriber Spacer 1 (ITS1). Os ensaios revelaram uma amostra com bandas entre 300 e 350 pares de base (pb). A amostra demonstrou 100% de identidade com Leishmania infantum (314 pb). Os resultados sugerem que o gado pode ser infectado por L. infantum no Brasil.

Comparison between tests for tuberculosis diagnosis in slaughtered bovines / Comparação entre testes de diagnóstico para tuberculose em bovinos abatidos

Our goal for this article is to compare several different diagnosis tests for bovine tuberculosis identification. We have performed bacterial isolation, histopathological characterization, acid-fast bacilli (AFB) identification and M. bovis DNA detection. Lesions suggestive of Tuberculosis were sampled from bovine lymph nodes during slaughtering of bovines at an abattoir that operates under federal inspection. The bacterial isolation was performed in solid culture mediums, the histopathological characterization was made by Hematoxylin-eosinstaining, and AFB identification by Ziehl-Neelsen staining. Bacterial DNA detection was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) using DNA from two different sources, directly collected from the tuberculosis-like lesions (PCR followed by nested PCR) and from isolated bacteria. We have concluded that the multi-step approach, including histopathological characterization, bacterial isolation and AFB identification, is strongly recommended to diagnose tuberculosis in bovines. Furthermore, PCR assays using specimens of lesions suggestive of tuberculosis are a faster and more promising way to diagnose the disease. However, it should not be used alone due to the low sensitivity shown in this study.(AU)

O objetivo deste estudo foi a comparação entre diferentes testes de diagnóstico para tuberculose bovina. Foram realizados o isolamento bacteriano, a caracterização histopatológica, a identificação de bacilos álcool-ácido resistentes e a detecção do DNA de M. bovis pela reação em cadeia da polimerase, em bovinos adultos abatidos em matadouros frigoríficos sob o Serviço de Inspeção Federal, valendo-se de amostras de linfonodos com lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose, identificadas e coletadas durante o abate. O isolamento bacteriano foi realizado pelo cultivo em meios de cultura sólidos; a caracterização histopatológica, pela coloração com hematoxilina-eosina; e a identificação de bacilos álcool-ácido resistentes foi feita pela coloração de Ziehl-Neelsen. A detecção de DNA foi realizada em amostra extraída das lesões sugestivas de tuberculose pela reação em cadeia da polimerase, seguida da nested reação em cadeia da polimerase e por meio das colônias isoladas para identificação do M. bovis, utilizando-se também da reação em cadeia da polimerase . Os resultados obtidos permitiram concluir que os testes histopatológicos, o isolamento bacteriano e a identificação de bacilos álcool-ácido resistentes são aconselháveis para o diagnóstico da tuberculose bovina. Além disso, ensaios de reação em cadeia da polimerase utilizando amostras de lesões sugestivas de tuberculose são um modo mais rápido e promissor para diagnosticar a enfermidade, no entanto não deve ser utilizado sozinho, em virtude da baixa sensibilidade apresentada neste estudo.(AU)

Evidence of heterozygosity and recombinant alleles in single cysts of Giardia duodenalis / Evidência de heterozigose e alelos recombinantes em cistos individualizados de Giardia duodenalis

Abstract Giardia duodenalis is divided into eight assemblages (named A to H). Isolates of assemblage A are divided into four sub-assemblages (AI, AII, AIII and AIV). While isolates of sub-assemblage AII are almost exclusively detected in human hosts, isolates of assemblage B are encountered in a multitude of animal hosts and humans. Here, we isolated single cysts of G. duodenalis from a human stool sample and found that one of them had overlaps of assemblage AII and B alleles and an unexpectedly high number of variants of the beta-giardin (Bg) and GLORF-C4 (OrfC4) alleles. In addition, one of the Bg alleles of that cyst had a fragment of sub-assemblage AII interspersed with fragments of assemblage B, thus indicating that this allele may be a recombinant between sequences A and B. Our results are unprecedented and put a check on the statement that different assemblages of G. duodenalis represent species with different host specificities.

Resumo A espécie Giardia duodenalis é dividida em oito grupos (nomeados de A a H). Isolados do grupo A são divididos em quatro subgrupos (AI, AII, AIII and AIV). Enquanto isolados do subgrupo AII são detectados quase exclusivamente em hospedeiros humanos, isolados do subgrupo B são encontrados em uma grande variedade de hospedeiros entre animais e humanos. Neste trabalho, foi constatado que, dentre diversos cistos individualizados de G. duodenalis provenientes de fezes de origem humana, um cisto continha os alelos AII e B e um número inesperado de variantes de alelos codificadores de beta giardina e GLORF-C4. Ainda, um dos alelos beta giardina desse cisto possuía fragmentos AII intercalando um fragmento B, indicando que esse alelo pode ser um recombinante entre alelos AII e B. Os resultados aqui apresentados são inéditos e colocam em dúvida o conceito atual de que os diferentes grupos de G. duodenalis representam espécies distintas com diferentes graus de especificidade por hospedeiros.

Molecular phylogeny of Toxoplasmatinae: comparison between inferences based on mitochondrial and apicoplast genetic sequences / Filogenia molecular de Toxoplasmatinae: comparação entre inferências baseadas em sequências genéticas mitocondriais e de apicoplasto

Abstract Phylogenies within Toxoplasmatinae have been widely investigated with different molecular markers. Here, we studied molecular phylogenies of the Toxoplasmatinae subfamily based on apicoplast and mitochondrial genes. Partial sequences of apicoplast genes coding for caseinolytic protease (clpC) and beta subunit of RNA polymerase (rpoB), and mitochondrial gene coding for cytochrome B (cytB) were analyzed. Laboratory-adapted strains of the closely related parasites Sarcocystis falcatula and Sarcocystis neurona were investigated, along with Neospora caninum, Neospora hughesi, Toxoplasma gondii (strains RH, CTG and PTG), Besnoitia akodoni, Hammondia hammondiand two genetically divergent lineages of Hammondia heydorni. The molecular analysis based on organellar genes did not clearly differentiate between N. caninum and N. hughesi, but the two lineages of H. heydorni were confirmed. Slight differences between the strains of S. falcatula and S. neurona were encountered in all markers. In conclusion, congruent phylogenies were inferred from the three different genes and they might be used for screening undescribed sarcocystid parasites in order to ascertain their phylogenetic relationships with organisms of the family Sarcocystidae. The evolutionary studies based on organelar genes confirm that the genusHammondia is paraphyletic. The primers used for amplification of clpC and rpoB were able to amplify genetic sequences of organisms of the genus Sarcocystisand organisms of the subfamily Toxoplasmatinae as well.

Resumo A filogenia da subfamília Toxoplasmatinae tem sido amplamente investigada com diversos marcadores moleculares. Neste estudo, a filogenia molecular da subfamília Toxoplasmatinae foi analisada através de genes de apicoplasto e mitocondriais. Foram analisadas sequências parciais de genes de apicoplasto codificadores da protease caseinolítica (clpC), e da subunidade beta da RNA polimerase (rpoB) e de gene mitocondrial codificador de citocromo B (cytB). Foram investigadas cepas adaptadas em laboratório de Sarcocystis neurona eSarcocystis falcatula, parasitos estreitamente relacionados, além de Neospora caninum, Neospora hughesi, Toxoplasma gondii (cepas RH, CTG e PTG),Besnoitia akodoni, Hammondia hammondi e duas linhagens geneticamente divergentes de Hammondia heydorni. A análise molecular, baseada em genes de organelas, não diferenciou claramenteN. caninum de N. hughesi, porém foi possível confirmar as duas linhagens de H. heydorni. Foram encontradas pequenas diferenças entre as cepas adaptadas em laboratório deS. falcatula e S. neurona em todos os marcadores moleculares avaliados. Concluindo, filogenias congruentes foram reconstruídas com os três diferentes genes que podem ser úteis em triagem de parasitos sarcocistídeos não identificados, para identificar sua relação com organismos da família Sarcocystidae. Os estudos evolutivos com genes organelares confirmam que o gênero Hammondia é parafilético. Osprimers utilizados para amplificação declpC e rpoB foram capazes de amplificar sequências genéticas de organismos do gênero Sarcocystis e da subfamília Toxoplasmatinae.

Prevalência e fatores de risco para a leptospirose e brucelose na população canina da Estância Turística de Ibiúna, São Paulo, Brasil / Prevalence and risk factors for leptospirosis and brucellosis in the canine population of the Tourist Resort of Ibiúna, State of São Paulo, Brazil

O objetivo do trabalho foi determinar a prevalência de leptospirose e brucelose por Brucella canis e determinar os fatores de risco associados com a positividade em cães da Estância Turística de Ibiúna, estado de São Paulo, Brasil. Foram examinados 570 animais distribuídos em 4 regiões nos 48 bairros do município, no período de setembro de 2007 a março de 2008. O diagnóstico sorológico da leptospirose foi efetuado com o teste de soroaglutinação microscópica (SAM), e para o diagnóstico de brucelose foi realizado hemocultivo. Dos 570 animais examinados, 187 (32,8%; IC95% 28,9 - 36,8) foram soropositivos para leptospirose, com predomínio de reações para os sorovares Pyrogenes, Autumnalis e Canicola, e 6 (1,05%; IC95% 0,4 - 2,2) foram positivos para brucelose. A variável atividade sexual (OR = 1,73) foi identificada como fator de risco associado à positividade para leptospirose, e o manejo do tipo solto foi considerado fator de risco tanto para leptospirose (OR = 1,96) quanto para brucelose (OR = 10,85). Conclui-se que a leptospirose e a brucelose estão presentes em cães da Estância Turística de Ibiúna, São Paulo, e que a atividade sexual e o acesso irrestrito à rua são condições associadas com a prevalência das infecções.(AU)

The aim of this survey was to determine the prevalence of leptospirosis and brucellosis due to Brucella canis and to determine the risk factors associated with positivity in dogs of the Tourist Resort of Ibiúna, State of São Paulo, Brazil. A total of 570 blood samples were collected from dogs from 4 regions of 48 districts of the county of Ibiúna during the period of September 2007 to March 2008. Serological diagnosis of leptospirosis was performed with the microscopic agglutination test (MAT), and blood culture was used for the diagnosis of brucellosis. Of the 570 dogs used 187 (32.8%; 95%CI 28.9 - 36.8) were seropositive to leptospirosis, with predominance of reactions to serovars Pyrogenes, Autumnalis and Canicola, and 6 (1.05%; 95%CI 0.4 - 2.2) were positive to brucellosis. Variable sexual activity (OR = 1.73) was identified as risk factor associated with the positivity to leptospirosis, and free access to street was considered risk factor for both leptospirosis (OR = 1.96) and brucellosis (OR = 10.85). It is concluded that leptospirosis and brucellosis are present in dogs of the Tourist Resort of Ibiúna, State of São Paulo, and sexual activity and free access to street are conditions associated with the prevalence of infections.(AU)

Antimicrobial susceptibility profile of brucella spp. isolated in Brazil

The intention of this work was to investigate the susceptibility profile of 27 Brucella strains isolated from animals in Brazil, using the E-test method with antimicrobials recommended for the treatment of human brucellosis, to monitor the activities of these antimicrobials and their potential efficacy for human brucellosis treatment. Efficiency of SE-AFLP in determining the genetic diversity of the species of Brucella and its correlation with their susceptibility profile was also evaluated. All 27 strains were susceptible to doxycycline. With the exception of one strain of B. canis and of B. abortus, all strains were susceptible to gentamicin and streptomycin. Of the wild Brucella strains tested, ten, nine and five showed reduced susceptibility to rifampicin, ceftriaxone and trimetoprim/sulfamethoxazole, respectively. One B. abortus and three B. canis strains showed multi-resistance profiles. The strain of B. abortus was resistant to streptomycin, rifampicin and ceftriaxone. Two strains of B. canis were resistant to rifampicin, ceftriaxone and trimetoprim/sulfamethoxazole, and one strain was resistant to rifampicin, ceftriaxone, streptomycin and gentamicin. Rifampicin, in combination with doxycycline, is one of the principal antibiotics prescribed to treat human brucellosis. The occurrence of strains resistant to rifampicin and other antimicrobials must be monitored before initiating this treatment, since the resistance of these strains could be one of the causes of the failure of some brucellosis treatment. No relationship was observed between SE-AFLP profiles and regional origin of the strains; neither between SE-AFLP profiles and antimicrobial profiles...

O objetivo deste trabalho foi investigar o perfil de susceptibilidade de 27 cepas de Brucella isoladas de animais no Brasil, utilizando-se o método E-test com os antimicrobianos recomendados para o tratamento da brucelose humana. Com este método, pretendeu-se monitorar a atividade destes antimicrobianos e seu potencial de eficacidade no tratamento desta enfermidade no homem. Também foi avaliada a eficiência da técnica SE-AFLP para discriminar as diferentes cepas de Brucella sp. e para analisar se os perfis gerados mostram alguma relação com os resultados de susceptibilidade. Todas as 27 cepas testadas foram sensíveis à doxiciclina, com exceção de uma cepa de B. canis e outra de B. abortus; as demais cepas foram sensíveis à gentamicina e à estreptomicina. Do total de cepas de campo testadas, respectivamente, dez, nove e cinco apresentaram susceptibilidade reduzida à rifampicina, ceftriaxona e trimetoprim/sulfametoxazol. Uma cepa de B. abortus e três de B. canis apresentaram perfil de multirresistência. A cepa de B. abortus mostrou-se resistente à estreptomicina, rifampicina e ceftriaxona. Duas cepas de B. canis foram resistentes à rifampicina, ceftriaxona e trimetoprim/sulfametoxazol e uma cepa foi resistente à rifampicina, ceftriaxona, streptomicina e gentamicina. Rifampicina e doxiciclina, associadas, são os principais antibióticos recomendados para o tratamento da brucelose humana. A ocorrência de cepas resistentes à rifampicina e outros antimicrobianos deve ser monitorada antes do início do tratamento, pois a resistência a esses antimicrobianos pode ser uma das causas do insucesso de alguns tratamentos de brucelose. Não foi observada nenhuma correlação entre os perfis SE- AFLP gerados e a origem das cepas, nem com os perfis de susceptibilidade destas cepas...

Detection of brucella ovis in ovine from Paraíba state, in the northeast region of Brazil

To determine the presence of Brucella ovis in ovine from Paraíba State, in the Northeast region of Brazil, 80 animals slaughtered in the public slaughterhouse of Patos city were used. Before slaughter, blood samples were collected by jugular venopuncture from each animal, and after slaughter, testicles, epidydimus and uterus were aseptically collected. For the serological diagnosis of B. ovis and B. abortus infections, the agar gel immunodiffusion (AGID) and Rose Bengal (RBT) tests were carried out, respectively. In addition, microbiological culture and polymerase chain reaction (PCR) were performed on testicle, epidydimus and uterus samples. Six animals (7.5 percent) tested positive for the presence of B. ovis antibodies and all animals tested negative for the presence of B. abortus antibodies. One AGID-positive animal tested positive at uterine swab culture. PCR was able to amplify DNA of Brucella spp. from the pool of testicle, epidydimus and uterus samples from AGID-positive animals. This is the first report of isolation and detection of B. ovis DNA by PCR in ovine from the Northeast region of Brazil.

Detection of Brucella abortus DNA in illegal cheese from São Paulo and Minas Gerais and differentiation of B19 vaccinal strain by means of the polymerase chain reaction (PCR)

A total of 192 samples of illegal cheese from different regions of the states of São Paulo and Minas Gerais, Brazil, were analyzed for the isolation and detection of Brucella spp. DNA by means of microbiological culture and polymerase chain reaction (PCR), respectively. Samples that yielded positive results were submitted to the analysis of the occurrence of Brucella abortus (biovars 1, 2 e 4), as well as to the differentiation of DNA in B19 vaccinal strain or Brucella abortus field strain using PCR. Although the microorganism was not isolated from any sample, PCR detected 37 positive samples (19.27 percent) using genus-specific primers. From these, all (100 percent) were Brucella abortus. Differentiation of the strain showed that 30/37 samples (81.08 percent) were vaccinal strain B19 and seven (18.92 percent) were Brucella abortus field strains. Results showed that diagnostic sensitivity of PCR was greater than that of microbiological culture. The standardization of the reaction for the differentiation of vaccinal and field strains enabled the analysis of all samples positive for Brucella abortus. It is, therefore, a reliable method, also applicable to natural infections caused by the microrganism.

Foram analisadas 192 amostras de queijo clandestinas provenientes de várias regiões do Estado de São Paulo e Minas Gerais, Brasil, para isolamento e detecção de DNA de Brucella spp. através das técnicas de cultivo microbiológico e reação da polimerase em cadeia (PCR), respectivamente. Para as amostras positivas foi pesquisada a ocorrência da espécie Brucella abortus (biovares 1, 2 e 4), além da diferenciação do DNA em cepa vacinal B19 ou de campo por PCR. Não foi possível isolar o microrganismo de nenhuma amostra, porém, na PCR, 37 amostras (19,27 por cento) foram positivas na reação com primers gênero específicos e destas, todas (100 por cento) foram comprovadas como sendo Brucella abortus. A diferenciação da cepa revelou que 30/37 amostras (81,08 por cento) eram cepa vacinal B19 e sete (18,92 por cento) eram cepas de Brucella abortus de campo. Os resultados mostraram uma maior sensibilidade diagnóstica da PCR em relação ao cultivo microbiológico, e a padronização da reação de diferenciação da cepa em vacinal ou campo permitiu que todas as amostras positivas para Brucella abortus fossem analisadas, sendo uma metodologia confiável e aplicável a infecções naturais pelo microrganismo.

Comparação de três testes sorológicos aplicados ao diagnóstico da infecção de caninos por Brucella canis / Comparison of three serological tests applied to diagnosis of the Brucella canis infection in dogs

Foram comparados os testes de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), imunodifusão em gel de ágar em soros tratados pelo 2-mercaptoetanol (IDGA-ME) e reação de fixação de complemento (CFT), aplicados ao diagnóstico da infecção de caninos por Brucella canis. O antígeno utilizado nas técnicas de IDGA e IDGA-ME constituiu-se de lipopolissacarídeos e proteínas de Brucella ovis, amostra Reo 198, e na CFT, o antígeno empregado foi a Brucella ovis, amostra 63/290. Foram examinadas 80 amostras de soro sanguíneo de cães colhidas durante a campanha de vacinação anti-rábica animal do Município de Santana de Parnaíba-SP, realizada em agosto de 1999. As provas sorológicas foram comparadas, duas a duas, pelo teste de Mc Nemar, e a concordância foi analisada pelo indicador Kappa. A concordância entre as técnicas de CFT e IDGA-ME foi regular (Kappa = 0,54), entre as técnicas de IDGA e CFT foi sofrível (Kappa = 0,36) e entre as provas de IDGA e IDGA-ME também foi sofrível (Kappa = 0,39).